Professor Layton and the Devil's Flute dévoile ses deux personnages principaux avec des artwoks mais aussi de nouvelles têtes comme Remi Altava, une collègue du Professeur, un étrange chat et d'autres acteurs qui viendront enrichir l'histoire de cette flûte diabolique dont on raconte qu'elle fut la cause de l'anéantissement d'une ville par un démon. Le jeu se déroulera trois années avant le premier opus, Professeur Layton et l’Étrange Village que nous connaissons. A cet instant, Luke et son Maître des énigmes ne se sont pas encore rencontrés. Le jeu sortira à l'automne 2009 au Japon.